生长抑素对肝星状细胞的影响机制
发布时间:2008-01-15 作者:路人乙 来源:网络资源
潘勤，李定国，汪余勤，徐芹芳，上海第二医科大学附属新华医院消化内科 上海市200092
潘勤，男，1971-03-12生，上海市人，汉族．1994年上海铁道医学院本科毕业，2000年上海第二医科大学硕士研究生毕业，现为上海第二医科大学博士研究生．主要从事肝纤维化的发生机制及药物防治研究．
项目负责人 潘勤，200092，上海市控江路1665号，上海第二医科大学附属新华医院. fangchunhua@online.sh.cn
电话:021-65790000-5319 传真:021-55296348
收稿日期 2002-05-02 接受日期 2002-06-10
Effects of somatostatin on activated rat hepatic stellate cells and its mechanisms
Qin Pan, Ding-Guo Li, Yue-Qin Wang, Qin-Fang Xue
Qin Pan, Ding-Guo Li, Yue-Qin Wang, Qin-Fang Xue, Department of Gastroenterology, Xin Hua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092, China
Correspondence to: Qin Pan, Xin Hua Hospital, 1665 KongJiang Road, Shanghai 200092, China. fangchunhua@online.sh.cn
Received 2002-05-02 Accepted 2002-06-10
Abstract
AIM:To investigate the effects of somatostatin on proliferation and apoptosis of activated rat hepatic stellate cells (HSCs).
METHODS:Being isolated from liver of SD rat by in situ perfusion with collagenase and pronase and density gradient, HSCs became activated after 10 days. Then the rates of apoptosis and proliferation of HSCs, which had been treated with different dosage of somatostatin, were measured by acridine orange/ethidium bromide fluorescent stain, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, transmission electron microscopy, flow cytometry and MTT assay. Furthermore, the mechanisms of somatostatin were investigated with the aid of cytodynamic analysis.
RESULTS:somatostatin was able to decrease the proliferation rate as well as promote the programmed cell death of activated rat HSCs.Its dose-dependent action,in which G0/G1 arrest played an important role, was strongest when the concentration of somatostatin reached 10-6mol/L or 10-7mol/L.
CONCLUSION:Anti-proliferative and proapoptotic effects on activated rat HSCs can be obtained by a low dose of somatostatin. These findings reveal the potential antifibrotic value of somatostatin.
Pan Q, Li DG, Wang YQ, Xue QF. Effects of somatostatin on activated rat hepatic stellate cells and its mechanisms. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2002;10(11): 1250-1252
摘要
目的:研究生长抑素(somatostatin，SST)与大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)增生、凋亡的关系．
方法:分离、培养的原代大鼠HSC，经不同浓度SST (10-6-10-10 mol/L)处理72 h后，以吖啶橙（acridine orange，AO）/溴乙啶（ethidium bromide，EB）荧光染色法、末端核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷原位缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）、透射电镜及流式细胞术检测其凋亡率的改变．SST作用120 h后，以甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法检测HSC增生率的变化.并通过对细胞动力学的观察,探讨SST的作用机制．
结果:SST可通过剂量依赖方式抑制HSC增生，提高HSC凋亡率．浓度为10-6 mol/L或10-7 mol/L时效果尤为显著．G0/G1期阻滞是SST发挥作用的重要途径．
结论:低剂量SST即可抑制HSC增生，并促进其凋亡，提示SST在抗肝纤维化方面具有潜在价值．
潘勤，李定国，汪余勤，徐芹芳．生长抑素对肝星状细胞的影响机制. 世界华人消化杂志 2002;10(11):1250-1252
0 引言
近年来，生长抑素（somatostatin，SST）在治疗肝硬化所致的上消化道出血中应用日益普遍[1]．同时，由于SST对细胞增生及EGF、TGF-a等促增值细胞因子的分泌具有广泛抑制作用，可能影响肝硬化形成的关键细胞-肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）乃至肝硬化本身．故我们尝试以不同浓度SST处理原代大鼠HSC，籍此了解SST对HSC增生、凋亡的影响及其具体机制．
1 材料和方法
1.1 材料 ♂SD大鼠，质量250-300 g（中国科学院上海实验动物中心）；SST（Serono公司），DMEM培养基（Gibco公司），MTT（Sigma公司），AO,EB（上海化学试剂采购供应站），TUNEL试剂盒（武汉博士德公司）；960型全自动酶标仪、Olympus IC50型荧光显微镜、FACS420型流式细胞仪、Hitachi H-500型透射电子显微镜．
1.2方法 大鼠HSC分离采用改良Friedman法[2，3]，经门静脉依次用无Ca2+灌流液、链霉蛋白酶溶液、胶原酶溶液灌流，然后剪碎肝脏，置于含链霉蛋白酶、胶原酶及DNA酶的溶液中震荡30 min．细胞悬液离心后洗3次，再加入Nycodenz离心．吸取表面的HSC，重悬于DMEM培养液中．台盼兰染色显示细胞存活率达90 ％以上，波长328 nm紫外线激发下90 %以上细胞发出蓝色荧光．培养10 d后95 %以上HSCa-SMA染色阳性．
1.2.1 HSC增生检测 将HSC接种于96孔培养板（约1×104/孔），分为对照组及5个浓度SST处理组（6复孔/组）．细胞贴壁后加入SST，使各组终浓度分别为0,10-6,10-7,10-8,10-9及10-1 0mol/L．培养5 d后再加MTT溶液，继续孵育4 h．弃上清液，加DMSO，于490 nm波长处测出各孔吸光度（A值），按下式计算：细胞抑制率=（1-给药孔平均A值/对照孔平均A值）×100 %．
1.2.2 HSC凋亡及细胞周期检测 按同样分组方法，将HSC接种入置有盖玻片的6孔培养板,以不同浓度SST作用72 h，并采用AO/EB荧光染色法[4]测定；流式细胞术：制作HSC悬液并以700 ml/L冷乙醇固定,细胞悬液中加10 g/LRNA酶，37 ℃孵育15 min．再加碘化丙啶1 mL，避光静置30 min后检测凋亡率及细胞周期;TUNEL法:每张盖玻片加TdT,DIG-dUTP1 mL,标记缓冲液18 mL及标记液20 mL,置37℃湿盒中2 h．然后依次加封闭液、Anti-DIG-Biotin及SABC，最终以DAB显色．随机取20个高倍镜视野，计数阳性细胞及凋亡指数；透射电镜检测：以20 ml/L戊二醛固定HSC，离心后包埋、切片，观察超微结构．
统计学处理 采用方差分析及t检验,以SPSS软件分析．
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